La extracción de ácidos nucleicos es el primer paso del protocolo de preparación de muestras mediante NGS. Los ácidos nucleicos son grandes biomoléculas esenciales para todas las formas de vida conocidas. Están compuestos de nucleótidos, que son monómeros formados por tres componentes: un azúcar, un fosfato y una base nitrogenada. Las dos clases principales de ácidos nucleicos son el ADN y el ARN. El azúcar del ARN es la ribosa, mientras que el del ADN es la desoxirribosa.
Diagrama que muestra la estructura del ARN (izquierda) y el ADN (derecha). El uracilo es la base que se empareja con la adenina en el ARN, mientras que la timina se empareja con la adenina en el ADN. Crédito de la imagen: Wikipedia
Tipos de extracción de ácidos nucleicos
Extracción de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo
Tras alterar la estructura celular del ácido nucleico, se utilizan DNasa y ARNasa para inactivar las nucleasas celulares. Los ácidos nucleicos deseados pueden entonces separarse de los restos celulares.
El fenol por sí solo es un ácido carbólico inflamable, corrosivo y tóxico. Sin embargo, se puede usar una mezcla de fenol, cloroformo y una pequeña cantidad de isoamilo para extraer ADN. Al añadir fenol y cloroformo a la muestra, se forma una emulsión que contiene una capa de ADN en la parte superior, debido a su naturaleza hidrófila. El ADN puede entonces recolectarse y precipitarse por centrifugación. El sedimento de ADN resultante puede disolverse con agua estéril.
Diagrama que muestra los pasos de la extracción con fenol-cloroformo: adición de la mezcla de fenol-cloroformo al lisado celular, centrifugación y posterior lavado con agua para obtener el ADN aislado. Crédito de la imagen: Eva Meszaros, 2021
La técnica de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo permite extraer ARN en un solo paso. Tras la extracción, el ARN se separa del ADN mediante una solución ácida compuesta por tiocianato de guanidinio, acetato de sodio, fenol y cloroformo. La recuperación del ARN se realiza mediante precipitación con isopropanol, lo que crea una condición ácida en la que el ARN permanece en la parte superior de la mezcla.
Centrifugación en gradiente de cloruro de cesio/bromuro de etidio
La centrifugación en gradiente de cloruro de cesio/bromuro de etidio se ha utilizado en laboratorios de investigación desde 1950. El método aprovecha las diferentes densidades entre los iones de cesio y el agua, junto con la intercalación de bromuro de etidio para interferir con la replicación, transcripción, reparación y recombinación del ADN.
Esta centrifugación en gradiente es un método complejo, costoso y lento en comparación con otros protocolos de aislamiento. Requiere una gran cantidad de muestra, por lo que no es adecuado para todos los tipos de secuenciación. Además, el bromuro de etidio es perjudicial. Por lo tanto, este método no se utiliza en el laboratorio clínico debido a sus limitaciones.
Extracción en fase sólida
La purificación de ácidos nucleicos en fase sólida se encuentra en la mayoría de los kits de extracción comerciales disponibles actualmente. Normalmente se realiza mediante una columna de centrifugación, que opera bajo fuerza centrífuga, lo que permite purificar el ADN de forma rápida y eficiente. La columna debe acondicionarse previamente para la absorción de la muestra, lo cual puede lograrse con un tampón a un pH determinado. Tras la disrupción celular, los ácidos nucleicos deseados se absorben en la columna debido al pH de la solución de unión. A continuación, se eliminan los contaminantes mediante un lavado con un agente competitivo y se introduce agua para liberar los ácidos nucleicos deseados de la columna.
Purificación basada en perlas magnéticas
La separación magnética se considera actualmente un método sencillo y eficiente para la purificación de ácidos nucleicos. Es una modificación de la extracción en fase sólida. Las perlas tienen una carga superficial negativa y se unen selectivamente a proteínas, como el ADN. En ocasiones, el proceso de unión puede facilitarse aplicando un imán al lateral del tubo, ya que este agrega las partículas cerca de la pared. El resto de la muestra, compuesto por restos celulares y material no deseado, puede desecharse. Los ácidos nucleicos se separan de las partículas magnéticas con un tampón y se eliminan los contaminantes restantes.
Diagrama que muestra el protocolo de purificación con perlas magnéticas. Crédito de la imagen: Andrew Gane, 2019
Este método sin duda presenta ventajas: no requiere centrifugación repetida, filtración al vacío ni separación en columna, lo que lo hace rentable y rápido. Existen numerosos kits comerciales, y algunos fabricantes incluso combinan perlas magnéticas con otras técnicas de extracción en fase sólida, como el uso de sílice. Estas tecnologías están ayudando a los científicos a mejorar la recuperación de ADN con solo pequeños volúmenes de muestra.
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